Eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi umani lil hinn mill-katina tqila tal-mijosina

Grazzi talli żort nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża l-aħħar verżjoni tal-browser (jew li tiddiżattiva l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, dan is-sit se jkun ħieles minn stili u JavaScript.
Il-muskolu skeletriku huwa tessut eteroġenju magħmul predominantement minn mijofibrilli, li fil-bnedmin huma tipikament ikklassifikati fi tliet tipi: wieħed "bil-mod" (tip 1) u tnejn "veloċi" (tipi 2A u 2X). Madankollu, l-eteroġeneità bejn u fi ħdan it-tipi tradizzjonali ta' mijofibrilli tibqa' mifhuma ħażin. Applikajna approċċi traskrittomiċi u proteomiċi għal 1050 u 1038 mijofibrilla individwali minn vastus lateralis uman, rispettivament. L-istudju proteomiku inkluda rġiel, u l-istudju traskrittomiku inkluda 10 irġiel u 2 nisa. Minbarra l-isoformi tal-katina tqila tal-mijosina, identifikajna proteini metaboliċi, proteini ribosomali, u proteini ġunzjonali ċellulari bħala sorsi ta' varjabilità intermijofibrilli multidimensjonali. Barra minn hekk, minkejja l-identifikazzjoni ta' gruppi ta' fibri bil-mod u veloċi, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-fibri tat-tip 2X huma fenotipikament indistinguibbli minn fibri oħra b'kontrazzjoni mgħaġġla. Barra minn hekk, il-klassifikazzjoni bbażata fuq il-katina tqila tal-mijosina mhijiex biżżejjed biex tiddeskrivi l-fenotip tal-mijofibri fil-mijopatiji nemalini. B'mod ġenerali, id-dejta tagħna tissuġġerixxi eteroġeneità multidimensjonali tal-mijofibri, b'sorsi ta' varjazzjoni li jestendu lil hinn mill-isoformi tal-katina tqila tal-mijosina.
L-eteroġeneità ċellulari hija karatteristika inerenti tas-sistemi bijoloġiċi kollha, li tippermetti liċ-ċelloli jispeċjalizzaw biex jissodisfaw il-bżonnijiet differenti tat-tessuti u ċ-ċelloli.1 Il-fehma tradizzjonali tal-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi kienet li n-newroni tal-mutur jiddefinixxu t-tip ta' fibra fi ħdan unità tal-mutur, u li t-tip ta' fibra (jiġifieri, tip 1, tip 2A, u tip 2X fil-bnedmin) huwa determinat mill-karatteristiċi tal-isoformi tal-katina tqila tal-mijosina (MYH).2 Dan inizjalment kien ibbażat fuq l-instabbiltà tal-pH ATPase tagħhom,3,4 u aktar tard fuq l-espressjoni molekulari tagħhom ta' MYH.5 Madankollu, bl-identifikazzjoni u l-aċċettazzjoni sussegwenti ta' fibri "mħallta" li jesprimu flimkien MYHs multipli fi proporzjonijiet varji, il-fibri tal-muskoli skeletriċi qed jitqiesu dejjem aktar bħala kontinwu aktar milli bħala tipi distinti ta' fibri.6 Minkejja dan, il-qasam għadu jiddependi ħafna fuq MYH bħala l-klassifikatur primarju għall-klassifikazzjoni tal-mijofibri, fehma x'aktarx influwenzata mil-limitazzjonijiet u l-preġudizzji sinifikanti ta' studji bikrija fuq annimali gerriema li l-profili ta' espressjoni MYH tagħhom u l-firxa ta' tipi ta' fibri huma differenti minn dawk fil-bnedmin.2 Is-sitwazzjoni hija aktar ikkumplikata mill-fatt li muskoli skeletriċi umani differenti juru firxa diversa ta' tipi ta' fibri.7 L- vastus lateralis huwa muskolu mħallat bi profil ta' espressjoni MYH intermedju (u għalhekk rappreżentattiv).7 Barra minn hekk, il-faċilità tiegħu ta' teħid ta' kampjuni tagħmilha l-muskolu l-aktar studjat fil-bnedmin.
Għalhekk, investigazzjoni imparzjali tad-diversità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi bl-użu ta' għodod "omiċi" qawwija hija kritika iżda wkoll ta' sfida, parzjalment minħabba n-natura multinukleata tal-fibri tal-muskoli skeletriċi. Madankollu, it-teknoloġiji tat-traskrittomika8,9 u l-proteomika10 għaddew minn rivoluzzjoni fis-sensittività f'dawn l-aħħar snin minħabba diversi avvanzi teknoloġiċi, li jippermettu l-analiżi tal-muskoli skeletriċi b'riżoluzzjoni ta' fibra waħda. B'riżultat ta' dan, sar progress sinifikanti fil-karatterizzazzjoni tad-diversità ta' fibra waħda u r-rispons tagħhom għal stimuli atrofiċi u tixjiħ11,12,13,14,15,16,17,18. Importanti, dawn l-avvanzi teknoloġiċi għandhom applikazzjonijiet kliniċi, li jippermettu karatterizzazzjoni aktar dettaljata u preċiża tad-disregolazzjoni assoċjata mal-mard. Pereżempju, il-patofiżjoloġija tal-mijopatija tan-nemalina, waħda mill-aktar mard komuni tal-muskoli li jintirtu (MIM 605355 u MIM 161800), hija kumplessa u konfuża.19,20 Għalhekk, karatterizzazzjoni aħjar tad-disregolazzjoni tal-fibri tal-muskoli skeletriċi tista' twassal għal avvanzi sinifikanti fil-fehim tagħna ta' din il-marda.
Żviluppajna metodi għall-analiżi traskrittomika u proteomika ta' fibri tal-muskoli skeletriċi singoli iżolati manwalment minn kampjuni ta' bijopsija umana u applikajnahom għal eluf ta' fibri, li jippermettulna ninvestigaw l-eteroġeneità ċellulari tal-fibri tal-muskoli skeletriċi umani. Matul dan ix-xogħol, wrejna l-qawwa tal-fenotipazzjoni traskrittomika u proteomika tal-fibri tal-muskoli u identifikajna proteini metaboliċi, ribosomali u ġunzjonali ċellulari bħala sorsi sinifikanti ta' varjabbiltà interfibri. Barra minn hekk, bl-użu ta' dan il-fluss tax-xogħol proteomiku, ikkaratterizzajna r-rilevanza klinika tal-mijopatija tan-nematodi f'fibri tal-muskoli skeletriċi singoli, u żvelajna bidla kkoordinata lejn fibri mhux ossidattivi indipendenti mit-tip ta' fibra bbażata fuq MYH.
Biex ninvestigaw l-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi umani, żviluppajna żewġ flussi tax-xogħol biex nippermettu l-analiżi tat-traskrittoma u l-proteoma ta' fibri tal-muskoli skeletriċi singoli (Figura 1A u Figura Supplimentari 1A). Żviluppajna u ottimizzajna diversi passi metodoloġiċi, mill-ħażna tal-kampjuni u l-preservazzjoni tal-integrità tal-RNA u l-proteini sal-ottimizzazzjoni tar-rendiment għal kull approċċ. Għall-analiżi tat-traskrittoma, dan inkiseb billi ddaħħlu barcodes molekulari speċifiċi għall-kampjun fil-pass inizjali tat-traskrizzjoni inversa, li ppermetta li 96 fibra jinġabru flimkien għal ipproċessar downstream effiċjenti. Sekwenzjar aktar profond (±1 miljun qari għal kull fibra) meta mqabbel mal-approċċi tradizzjonali ta' ċellula waħda arrikkixxi aktar id-dejta tat-traskrittoma. 21 Għall-proteomika, użajna gradjent kromatografiku qasir (21 minuta) flimkien mal-akkwist tad-dejta DIA-PASEF fuq spettrometru tal-massa timsTOF biex nottimizzaw il-fond tal-proteoma filwaqt li nżammew rendiment għoli. 22,23 Biex ninvestigaw l-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi b'saħħithom, ikkaratterizzajna t-traskrittomi ta' 1,050 fibra individwali minn 14 donatur adult b'saħħtu u l-proteomi ta' 1,038 fibra minn 5 donaturi adulti b'saħħithom (Tabella Supplimentari 1). F'dan id-dokument, dawn is-settijiet tad-dejta huma msejħa t-traskrittomi u l-proteomi ta' 1,000 fibra, rispettivament. L-approċċ tagħna skopra total ta' 27,237 traskritt u 2,983 proteina fl-analiżi traskrittomika u proteomika ta' 1,000 fibra (Figura 1A, Settijiet tad-Dejta Supplimentari 1–2). Wara li ffiltrajna s-settijiet tad-dejta traskrittomika u proteomika għal >1,000 ġene skopert u 50% valuri validi għal kull fibra, twettqu analiżi bijoinformatika sussegwenti għal 925 u 974 fibra fit-traskrittoma u l-proteoma, rispettivament. Wara l-iffiltrar, instabet medja ta' 4257 ± 1557 ġene u 2015 ± 234 proteina (medja ± SD) għal kull fibra, b'varjabbiltà inter-individwali limitata (Figuri Supplimentari 1B–C, Settijiet ta' Dejta Supplimentari 3–4). Madankollu, il-varjabbiltà fi ħdan is-suġġett kienet aktar evidenti bejn il-parteċipanti, x'aktarx minħabba differenzi fir-rendiment tal-RNA/proteina bejn fibri ta' tulijiet differenti u żoni trasversali. Għal ħafna proteini (>2000), il-koeffiċjent tal-varjazzjoni kien taħt l-20% (Figura Supplimentari 1D). Iż-żewġ metodi ppermettew li tinqabad firxa dinamika wiesgħa ta' traskrizzjonijiet u proteini b'firem espressi ħafna importanti għall-kontrazzjoni tal-muskoli (eż., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figuri Supplimentari 1E–F). Il-biċċa l-kbira tal-karatteristiċi identifikati kienu komuni bejn is-settijiet tad-dejta traskrittomiċi u proteomiċi (Figura Supplimentari 1G), u l-intensitajiet medji tal-UMI/LFQ ta’ dawn il-karatteristiċi kienu korrelati raġonevolment tajjeb (r = 0.52) (Figura Supplimentari 1H).
Fluss tax-xogħol tat-traskrittomika u l-proteomika (maħluq b'BioRender.com). Kurvi tal-firxa dinamika BD għal MYH7, MYH2, u MYH1, u limiti kkalkulati għall-assenjazzjoni tat-tip ta' fibra. E, F Distribuzzjoni tal-espressjoni MYH bejn il-fibri f'settijiet ta' dejta tat-traskrittomika u l-proteomika. G, H Plotts ta' Approssimazzjoni u Projezzjoni tad-Diversità Uniformi (UMAP) għat-traskrittomika u l-proteomika kkuluriti skont it-tip ta' fibra bbażat fuq MYH. I, J Plotts tal-karatteristiċi li juru l-espressjoni MYH7, MYH2, u MYH1 f'settijiet ta' dejta tat-traskrittomika u l-proteomika.
Inizjalment iddeċidejna li nassenjaw tip ta' fibra bbażata fuq MYH lil kull fibra billi użajna approċċ ottimizzat li jieħu vantaġġ mis-sensittività għolja u l-firxa dinamika tal-espressjoni MYH f'settijiet ta' dejta omika. Studji preċedenti użaw limiti arbitrarji biex jittikkettaw il-fibri bħala tip 1 pur, tip 2A, tip 2X, jew imħallta bbażati fuq perċentwal fiss ta' espressjoni ta' MYHs differenti11,14,24. Użajna approċċ differenti fejn l-espressjoni ta' kull fibra ġiet ikklassifikata skont l-MYHs li użajna biex nittajpjaw il-fibri: MYH7, MYH2, u MYH1, li jikkorrispondu għal fibri tat-tip 1, tip 2A, u tip 2X, rispettivament. Imbagħad ikkalkulajna matematikament il-punt ta' inflessjoni aktar baxx ta' kull kurva li tirriżulta u użajnieh bħala limitu biex nassenjaw fibri bħala pożittivi ('il fuq mil-limitu) jew negattivi (taħt il-limitu) għal kull MYH (Figura 1B–D). Din id-dejta turi li MYH7 (Figura 1B) u MYH2 (Figura 1C) għandhom profili ta' espressjoni mixgħula/mitfija aktar distinti fil-livell tal-RNA meta mqabbla mal-livell tal-proteina. Tabilħaqq, fil-livell tal-proteina, ftit ħafna fibri ma esprimewx MYH7, u l-ebda fibra ma kellha 100% espressjoni ta' MYH2. Imbagħad użajna limiti ta' espressjoni predeterminati biex nassenjaw tipi ta' fibri bbażati fuq MYH lill-fibri kollha f'kull sett ta' dejta. Pereżempju, il-fibri MYH7+/MYH2-/MYH1- ġew assenjati lit-tip 1, filwaqt li l-fibri MYH7-/MYH2+/MYH1+ ġew assenjati lit-tip imħallat 2A/2X (ara t-Tabella Supplimentari 2 għal deskrizzjoni sħiħa). Meta ġbarna l-fibri kollha, osservajna distribuzzjoni notevolment simili tat-tipi ta' fibri bbażati fuq MYH kemm fil-livelli tal-RNA (Figura 1E) kif ukoll tal-proteina (Figura 1F), filwaqt li l-kompożizzjoni relattiva tat-tipi ta' fibri bbażati fuq MYH varjat bejn l-individwi, kif mistenni (Figura Supplimentari 2A). Il-biċċa l-kbira tal-fibri ġew ikklassifikati jew bħala tip 1 pur (34–35%) jew tip 2A (36–38%), għalkemm instab ukoll numru sinifikanti ta' fibri mħallta tat-tip 2A/2X (16–19%). Differenza impressjonanti hija li l-fibri puri tat-tip 2X setgħu jiġu skoperti biss fil-livell tal-RNA, iżda mhux fil-livell tal-proteina, u dan jissuġġerixxi li l-espressjoni rapida tal-MYH hija għall-inqas parzjalment regolata wara t-traskrizzjoni.
Aħna vvalidajna l-metodu tagħna ta' ttajpjar tal-fibra MYH ibbażat fuq il-proteomika bl-użu ta' dot blotting ibbażat fuq antikorpi, u ż-żewġ metodi kisbu qbil ta' 100% fl-identifikazzjoni ta' fibri puri tat-tip 1 u tat-tip 2A (ara l-Figura Supplimentari 2B). Madankollu, l-approċċ ibbażat fuq il-proteomika kien aktar sensittiv, aktar effiċjenti fl-identifikazzjoni ta' fibri mħallta, u fil-kwantifikazzjoni tal-proporzjon ta' kull ġene MYH f'kull fibra. Din id-dejta turi l-effettività tal-użu ta' approċċ oġġettiv u sensittiv ħafna bbażat fuq l-omika biex jikkaratterizza t-tipi ta' fibri tal-muskoli skeletali.
Imbagħad użajna l-informazzjoni kkombinata pprovduta mit-transkriptomika u l-proteomika biex nikklassifikaw b'mod oġġettiv il-mijofibri bbażati fuq it-transkriptoma jew il-proteoma kompluta tagħhom. Bl-użu tal-metodu ta' approssimazzjoni u projezzjoni uniformi tal-manifold (UMAP) biex innaqqsu d-dimensjonalità għal sitt komponenti prinċipali (Figuri Supplimentari 3A–B), stajna nivviżwalizzaw il-varjabbiltà tal-mijofibri fit-transkriptoma (Figura 1G) u l-proteoma (Figura 1H). Notevolment, il-mijofibri ma ġewx miġbura skont il-parteċipanti (Figuri Supplimentari 3C–D) jew il-jiem tal-ittestjar (Figura Supplimentari 3E) la fid-datasets tat-transkriptomika u lanqas f'dawk tal-proteomika, li jissuġġerixxi li l-varjabbiltà fi ħdan is-suġġett fil-fibri tal-muskoli skeletriċi hija ogħla mill-varjabbiltà bejn is-suġġetti. Fil-plott tal-UMAP, ħarġu żewġ gruppi distinti li jirrappreżentaw mijofibri "veloċi" u "bil-mod" (Figuri 1G–H). Il-mijofibri MYH7+ (bil-mod) kienu miġbura fil-pol pożittiv ta' UMAP1, filwaqt li l-mijofibri MYH2+ u MYH1+ (veloċi) kienu miġbura fil-pol negattiv ta' UMAP1 (Figuri 1I–J). Madankollu, ma saret l-ebda distinzjoni bejn it-tipi ta' fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla (jiġifieri, tip 2A, tip 2X, jew imħallta 2A/2X) ibbażata fuq l-espressjoni MYH, li tissuġġerixxi li l-espressjoni ta' MYH1 (Figura 1I–J) jew markaturi klassiċi oħra ta' mijofibri 2X bħal ACTN3 jew MYLK2 (Figuri Supplimentari 4A–B) ma tiddistingwix bejn tipi differenti ta' mijofibri meta wieħed jikkunsidra t-traskrittoma jew il-proteoma kollha. Barra minn hekk, meta mqabbla ma' MYH2 u MYH7, ftit traskritti jew proteini kienu korrelati b'mod pożittiv ma' MYH1 (Figuri Supplimentari 4C–H), li tissuġġerixxi li l-abbundanza ta' MYH1 ma tirriflettix bis-sħiħ it-traskrittoma/proteoma tal-mijofibri. Intlaħqu konklużjonijiet simili meta ġiet evalwata l-espressjoni mħallta tat-tliet isoformi MYH fil-livell UMAP (Figuri Supplimentari 4I–J). Għalhekk, filwaqt li l-fibri 2X jistgħu jiġu identifikati fil-livell tat-traskrizzjoni abbażi tal-kwantifikazzjoni MYH biss, il-fibri MYH1+ mhumiex distinti minn fibri veloċi oħra meta jiġi kkunsidrat it-traskrizzjoni jew il-proteoma kollha.
Bħala esplorazzjoni inizjali tal-eteroġeneità tal-fibri bil-mod lil hinn minn MYH, ivvalutajna erba' proteini stabbiliti speċifiċi għat-tip ta' fibra bil-mod: TPM3, TNNT1, MYL3, u ATP2A22. Is-sottotipi ta' fibri bil-mod urew korrelazzjonijiet ta' Pearson għoljin, għalkemm mhux perfetti, ma' MYH7 kemm fit-traskrittomika (Figura Supplimentari 5A) kif ukoll fil-proteomika (Figura Supplimentari 5B). Madwar 25% u 33% tal-fibri bil-mod ma ġewx ikklassifikati bħala fibri bil-mod puri mis-sottotipi kollha tal-ġeni/proteini fit-traskrittomika (Figura Supplimentari 5C) u l-proteomika (Figura Supplimentari 5D), rispettivament. Għalhekk, il-klassifikazzjoni tal-fibri bil-mod ibbażata fuq sottotipi multipli ta' ġeni/proteini tintroduċi kumplessità addizzjonali, anke għal proteini magħrufa li huma speċifiċi għat-tip ta' fibra. Dan jissuġġerixxi li l-klassifikazzjoni tal-fibri bbażata fuq isoformi ta' familja waħda ta' ġeni/proteini tista' ma tirriflettix b'mod adegwat l-eteroġeneità vera tal-fibri tal-muskoli skeletriċi.
Biex nesploraw aktar il-varjabbiltà fenotipika tal-fibri tal-muskoli skeletriċi umani fuq l-iskala tal-mudell omics kollu, wettaqna tnaqqis imparzjali fid-dimensjonalità tad-dejta bl-użu tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) (Figura 2A). Simili għall-plottijiet UMAP, la l-parteċipant u lanqas il-jum tal-ittestjar ma influwenzaw ir-raggruppament tal-fibri fil-livell PCA (Figuri Supplimentari 6A–C). Fiż-żewġ settijiet ta' dejta, it-tip ta' fibra bbażata fuq MYH ġie spjegat minn PC2, li wera raggruppament ta' fibri tat-tip 1 b'kontrazzjoni bil-mod u t-tieni raggruppament li fih fibri tat-tip 2A, tat-tip 2X, u fibri mħallta 2A/2X b'kontrazzjoni mgħaġġla (Figura 2A). Fiż-żewġ settijiet ta' dejta, dawn iż-żewġ raggruppamenti kienu konnessi minn numru żgħir ta' fibri mħallta tat-tip 1/2A. Kif mistenni, l-analiżi tar-rappreżentazzjoni żejda tas-sewwieqa ewlenin tal-PC ikkonfermat li l-PC2 kien immexxi minn firem kontrattili u metaboliċi (Figura 2B u Figuri Supplimentari 6D–E, Settijiet ta' Dejta Supplimentari 5–6). B'mod ġenerali, it-tip ta' fibra bbażata fuq MYH instab li kien biżżejjed biex jispjega l-varjazzjoni kontinwa tul PC2, bl-eċċezzjoni tal-hekk imsejħa fibri 2X li kienu mqassma mat-traskrittoma kollu fi ħdan il-grupp veloċi.
A. Plottijiet tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) tad-datasets tat-traskrittomi u l-proteomi kkuluriti skont it-tip ta' fibra bbażata fuq MYH. B. Analiżi tal-arrikkiment tas-sewwieqa tat-traskritti u l-proteini fil-PC2 u l-PC1. L-analiżi statistika twettqet bl-użu tal-pakkett clusterProfiler u l-valuri-p aġġustati minn Benjamini-Hochberg. C, D. Plottijiet tal-PCA kkuluriti skont it-termini tal-ontoloġija tal-ġeni tal-adeżjoni interċellulari (GO) fit-traskrittomi u t-termini tal-kostameri GO fil-proteomi. Il-vleġeġ jirrappreżentaw is-sewwieqa tat-traskritti u l-proteini u d-direzzjonijiet tagħhom. E, F. Plottijiet tal-karatteristiċi tal-approssimazzjoni u l-projezzjoni tal-manifold uniformi (UMAP) ta' karatteristiċi klinikament rilevanti li juru gradjenti ta' espressjoni indipendenti mit-tip ta' fibra bil-mod/veloċi. G, H. Korrelazzjonijiet bejn is-sewwieqa tal-PC2 u l-PC1 fit-traskrittomi u l-proteomi.
B'mod mhux mistenni, it-tip ta' mijofibra bbażata fuq MYH spjega biss it-tieni l-ogħla grad ta' varjabbiltà (PC2), li jissuġġerixxi li fatturi bijoloġiċi oħra mhux relatati mat-tip ta' mijofibra bbażata fuq MYH (PC1) għandhom rwol importanti fir-regolazzjoni tal-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletali. Analiżi ta' rappreżentazzjoni żejda tal-muturi ewlenin fil-PC1 żvelat li l-varjabbiltà fil-PC1 kienet primarjament determinata mill-adeżjoni taċ-ċellula-ċellula u l-kontenut tar-ribosomi fit-traskrittoma, u l-kostameri u l-proteini ribosomali fil-proteoma (Figura 2B u Figuri Supplimentari 6D–E, Sett ta' Dejta Supplimentari 7). Fil-muskolu skeletali, il-kostameri jgħaqqdu d-diska Z mas-sarkolemma u huma involuti fit-trażmissjoni u s-sinjalar tal-forza. 25 Plottijiet PCA annotati bl-użu tal-karatteristiċi tal-adeżjoni taċ-ċellula-ċellula (traskrittoma, Figura 2C) u l-kostameri (proteoma, Figura 2D) żvelaw bidla qawwija lejn ix-xellug fil-PC1, li tindika li dawn il-karatteristiċi huma arrikkiti f'ċerti fibri.
Eżami aktar dettaljat tal-aggregazzjoni tal-mijofibri fil-livell UMAP żvela li l-biċċa l-kbira tal-karatteristiċi wrew gradjent ta' espressjoni bbażat fuq MYH indipendenti mit-tip ta' mijofibra aktar milli speċifiku għas-sottogrupp ta' mijofibri. Din il-kontinwità ġiet osservata għal diversi ġeni assoċjati ma' kundizzjonijiet patoloġiċi (Figura 2E), bħal CHCHD10 (marda newromuskolari), SLIT3 (atrofija tal-muskoli), CTDNEP1 (marda tal-muskoli). Din il-kontinwità ġiet osservata wkoll fil-proteoma kollu, inklużi proteini assoċjati ma' disturbi newroloġiċi (UGDH), sinjalazzjoni tal-insulina (PHIP), u traskrizzjoni (HIST1H2AB) (Figura 2F). Kollettivament, din id-dejta tindika kontinwità fl-eteroġeneità tat-twitch bil-mod/veloċi indipendenti mit-tip ta' fibra f'mijofibri differenti.
Interessanti, il-ġeni li jmexxu l-affarijiet fil-PC2 urew korrelazzjoni tajba bejn it-traskrittoma u l-proteoma (r = 0.663) (Figura 2G), li tissuġġerixxi li t-tipi ta' fibri b'kontrazzjoni bil-mod u mgħaġġla, u b'mod partikolari l-proprjetajiet kontrattili u metaboliċi tal-fibri tal-muskoli skeletali, huma regolati traskrizzjonalment. Madankollu, il-ġeni li jmexxu l-affarijiet fil-PC1 ma wrew l-ebda korrelazzjoni bejn it-traskrittoma u l-proteoma (r = -0.027) (Figura 2H), li tissuġġerixxi li l-varjazzjonijiet mhux relatati mat-tipi ta' fibri b'kontrazzjoni bil-mod/mgħaġġla huma fil-biċċa l-kbira regolati wara t-traskrizzjoni. Minħabba li l-varjazzjonijiet fil-PC1 ġew spjegati primarjament b'termini ta' ontoloġija tal-ġeni ribosomali, u peress li r-ribosomi għandhom rwol kruċjali u speċjalizzat fiċ-ċellula billi jipparteċipaw b'mod attiv fit-traduzzjoni tal-proteini u jinfluwenzawha,31 imbagħad bdejna ninvestigaw din l-eteroġeneità ribosomali mhux mistennija.
L-ewwel ikkulurijna l-plott tal-analiżi tal-komponenti prinċipali tal-proteomika skont l-abbundanza relattiva tal-proteini fit-terminu GOCC "ribosoma ċitoplasmika" (Figura 3A). Għalkemm dan it-terminu huwa arrikkit fuq in-naħa pożittiva tal-PC1, li jirriżulta fi gradjent żgħir, il-proteini ribosomali jmexxu t-tqassim fiż-żewġ direzzjonijiet tal-PC1 (Figura 3A). Il-proteini ribosomali arrikkiti fuq in-naħa negattiva tal-PC1 inkludew RPL18, RPS18, u RPS13 (Figura 3B), filwaqt li RPL31, RPL35, u RPL38 (Figura 3C) kienu l-muturi ewlenin fuq in-naħa pożittiva tal-PC1. Interessanti, RPL38 u RPS13 kienu espressi ħafna fil-muskolu skeletriku meta mqabbla ma' tessuti oħra (Figura Supplimentari 7A). Dawn il-firem ribosomali distintivi fil-PC1 ma ġewx osservati fit-traskrittoma (Figura Supplimentari 7B), li jindika regolazzjoni wara t-traskrizzjoni.
A. Plott tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) ikkulurit skont it-termini tal-ontoloġija tal-ġene ribosomali ċitoplasmiku (GO) tul il-proteoma. Il-vleġeġ jindikaw id-direzzjoni tal-varjazzjoni medjata mill-proteini fil-plott tal-PCA. It-tul tal-linja jikkorrispondi mal-punteġġ tal-komponent prinċipali għal proteina partikolari. B, Ċ. Plotts tal-karatteristiċi tal-PCA għal RPS13 u RPL38. D. Analiżi ta' raggruppament ġerarkiku mhux sorveljat ta' proteini ribosomali ċitoplasmiċi. E. Mudell strutturali tar-ribosoma 80S (PDB: 4V6X) li jenfasizza proteini ribosomali b'abbundanzi differenti fil-fibri tal-muskoli skeletriċi. F. Proteini ribosomali b'stojkjometrija differenti lokalizzati ħdejn il-kanal tal-ħruġ tal-mRNA.
Il-kunċetti ta' eteroġeneità u speċjalizzazzjoni ribosomali ġew proposti qabel, fejn il-preżenza ta' sottopopolazzjonijiet distinti ta' ribosomali (eteroġeneità ribosomali) tista' tinfluwenza direttament it-traduzzjoni tal-proteini f'tessuti32 u ċelloli33 differenti permezz tat-traduzzjoni selettiva ta' gruppi speċifiċi ta' traskrizzjonijiet tal-mRNA34 (speċjalizzazzjoni ribosomali). Biex nidentifikaw sottopopolazzjonijiet ta' proteini ribosomali ko-espressi f'fibri tal-muskoli skeletali, wettaqna analiżi ta' raggruppament ġerarkiku mhux sorveljat ta' proteini ribosomali fil-proteoma (Figura 3D, Sett ta' Dejta Supplimentari 8). Kif mistenni, il-proteini ribosomali ma ġewx raggruppati skont it-tip ta' fibra bbażat fuq MYH. Madankollu, identifikajna tliet raggruppamenti distinti ta' proteini ribosomali; l-ewwel raggruppament (ribosomal_cluster_1) huwa koregolat ma' RPL38 u għalhekk għandu espressjoni miżjuda f'fibri bi profil PC1 pożittiv. It-tieni raggruppament (ribosomal_cluster_2) huwa koregolat ma' RPS13 u huwa elevat f'fibri bi profil PC1 negattiv. It-tielet raggruppament (ribosomal_cluster_3) ma jurix espressjoni differenzjali kkoordinata fil-fibri tal-muskoli skeletriċi u jista' jitqies bħala l-proteina ribosomali tal-muskoli skeletriċi "ewlenija". Iż-żewġ raggruppamenti ribosomali 1 u 2 fihom proteini ribosomali li qabel intwerew li jirregolaw it-traduzzjoni alternattiva (eż., RPL10A, RPL38, RPS19, u RPS25) u jinfluwenzaw funzjonalment l-iżvilupp (eż., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Konsistenti mar-riżultati tal-PCA, ir-rappreżentazzjoni eteroġenja osservata ta' dawn il-proteini ribosomali fil-fibri kollha wriet ukoll kontinwità (Figura Supplimentari 7C).
Biex nivviżwalizzaw il-post tal-proteini ribosomali eteroġenji fir-ribosoma, użajna mudell strutturali tar-ribosoma 80S umana (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Wara li iżolajna proteini ribosomali li jappartjenu għal gruppi ribosomali differenti, il-postijiet tagħhom ma kinux allinjati mill-qrib, u dan jissuġġerixxi li l-approċċ tagħna naqas milli jipprovdi arrikkiment għal ċerti reġjuni/frazzjonijiet tar-ribosoma. Interessanti, madankollu, il-proporzjon ta' proteini ta' subunità kbar fil-grupp 2 kien aktar baxx milli fil-gruppi 1 u 3 (Figura Supplimentari 7D). Osservajna li proteini b'stojkjometrija mibdula fil-fibri tal-muskoli skeletriċi kienu predominantement lokalizzati fuq il-wiċċ tar-ribosoma (Figura 3E), konsistenti mal-abbiltà tagħhom li jinteraġixxu ma' elementi interni tas-sit tad-dħul tar-ribosoma (IRES) f'popolazzjonijiet differenti ta' mRNA, u b'hekk jikkoordinaw traduzzjoni selettiva. 40, 41 Barra minn hekk, ħafna proteini b'stojkjometrija mibdula fil-fibri tal-muskoli skeletriċi kienu jinsabu ħdejn reġjuni funzjonali bħall-mina tal-ħruġ tal-mRNA (Figura 3F), li jirregolaw b'mod selettiv it-titwil tat-traduzzjoni u l-arrest ta' peptidi speċifiċi. 42 Fil-qosor, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-istokjometrija tal-proteini ribosomali tal-muskoli skeletriċi turi eteroġeneità, li tirriżulta f'differenzi bejn il-fibri tal-muskoli skeletriċi.
Imbagħad ridna nidentifikaw firem ta' fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla u bil-mod u nesploraw il-mekkaniżmi tar-regolazzjoni traskrizzjonali tagħhom. Meta qabbilna l-gruppi ta' fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla u bil-mod definiti minn UMAP fiż-żewġ settijiet ta' dejta (Figuri 1G–H u 4A–B), analiżi traskrittomika u proteomika identifikaw 1366 u 804 karatteristika b'abbundanza differenzjali, rispettivament (Figuri 4A–B, Settijiet ta' Dejta Supplimentari 9–12). Osservajna d-differenzi mistennija fil-firem relatati mas-sarkomeri (eż., tropomjosina u troponina), l-akkoppjar ta' eċċitazzjoni-kontrazzjoni (isoformi SERCA), u l-metaboliżmu tal-enerġija (eż., ALDOA u CKB). Barra minn hekk, it-traskrizzjonijiet u l-proteini li jirregolaw l-ubikwitinazzjoni tal-proteini ġew espressi b'mod differenzjali f'fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla u bil-mod (eż., USP54, SH3RF2, USP28, u USP48) (Figuri 4A–B). Barra minn hekk, il-ġene tal-proteina mikrobjali RP11-451G4.2 (DWORF), li qabel intwera li huwa espress b'mod differenzjali fit-tipi ta' fibri tal-muskoli tal-ħaruf43 u jtejjeb l-attività SERCA fil-muskolu kardijaku44, kien regolat b'mod sinifikanti fil-fibri tal-muskoli skeletriċi bil-mod (Figura 4A). Bl-istess mod, fil-livell tal-fibra individwali, ġew osservati differenzi sinifikanti f'firem magħrufa bħal isoformi ta' lactate dehydrogenase relatati mal-metaboliżmu (LDHA u LDHB, Figura 4C u Figura Supplimentari 8A)45,46 kif ukoll firem speċifiċi għat-tip ta' fibra li qabel ma kinux magħrufa (bħal IRX3, USP54, USP28, u DPYSL3) (Figura 4C). Kien hemm koinċidenza sinifikanti ta' karatteristiċi espressi b'mod differenzjali bejn is-settijiet tad-dejta traskrittomiċi u proteomiċi (Figura Supplimentari 8B), kif ukoll korrelazzjoni ta' bidla fil-ħin immexxija prinċipalment mill-espressjoni differenzjali aktar qawwija tal-karatteristiċi tas-sarkomeri (Figura Supplimentari 8C). Ta' min jinnota li xi firem (eż. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) urew regolazzjoni qawwija wara t-traskrizzjoni biss fil-livell proteomiku u kellhom profili ta' espressjoni speċifiċi għat-tip ta' fibra b'kontrazzjoni bil-mod/veloċi (Figura Supplimentari 8C).
Plottijiet tal-vulkan A u B li jqabblu gruppi bil-mod u veloċi identifikati mill-plottijiet tal-approssimazzjoni u l-projezzjoni tal-manifold uniformi (UMAP) fil-Figuri 1G–H. Tikek ikkuluriti jirrappreżentaw traskrizzjonijiet jew proteini li huma sinifikament differenti f'FDR < 0.05, u tikek iktar skuri jirrappreżentaw traskrizzjonijiet jew proteini li huma sinifikament differenti f'bidla fil-logaritmu > 1. Analiżi statistika f'żewġ direzzjonijiet twettqet bl-użu tat-test DESeq2 Wald b'valuri p aġġustati minn Benjamini-Hochberg (traskrittomika) jew il-metodu tal-mudell lineari Limma b'analiżi Bayesjana empirika segwita minn aġġustament ta' Benjamini-Hochberg għal paraguni multipli (proteomika). C Plottijiet tal-firma ta' ġeni jew proteini magħżula espressi b'mod differenzjali bejn fibri bil-mod u veloċi. D Analiżi ta' arrikkiment ta' traskrizzjonijiet u proteini espressi b'mod differenzjali sinifikanti. Valuri li jikkoinċidu huma arrikkiti fiż-żewġ settijiet tad-dejta, valuri tat-traskrittoma huma arrikkiti biss fit-traskrittoma, u valuri tal-proteoma huma arrikkiti biss fil-proteoma. Analiżi statistika twettqet bl-użu tal-pakkett clusterProfiler b'valuri p aġġustati minn Benjamini-Hochberg. E. Fatturi ta' traskrizzjoni speċifiċi għat-tip ta' fibra identifikati minn SCENIC ibbażati fuq punteġġi ta' speċifiċità tar-regolatur derivati ​​minn SCENIC u espressjoni differenzjali tal-mRNA bejn it-tipi ta' fibri. F. Profiljar ta' fatturi ta' traskrizzjoni magħżula espressi b'mod differenzjali bejn fibri bil-mod u veloċi.
Imbagħad wettaqna analiżi ta' rappreżentazzjoni żejda ta' ġeni u proteini rappreżentati b'mod differenzjali (Figura 4D, Sett ta' Dejta Supplimentari 13). L-arrikkiment tal-mogħdijiet għal karatteristiċi li kienu differenti bejn iż-żewġ settijiet ta' dejta żvela differenzi mistennija, bħal proċessi ta' β-ossidazzjoni ta' aċidi grassi u metaboliżmu ta' ketoni (fibri bil-mod), kontrazzjoni ta' mijofilament/muskoli (fibri veloċi u bil-mod, rispettivament), u proċessi kataboliċi tal-karboidrati (fibri veloċi). L-attività tal-fosfatażi tal-proteina tas-serina/treonina kienet ukoll elevata fil-fibri veloċi, immexxija minn karatteristiċi bħas-subunitajiet tal-fosfatażi regolatorji u katalitiċi (PPP3CB, PPP1R3D, u PPP1R3A), li huma magħrufa li jirregolaw il-metaboliżmu tal-glikoġenu (47) (Figuri Supplimentari 8D–E). Mogħdijiet oħra arrikkiti f'fibri veloċi inkludew korpi tal-ipproċessar (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) fil-proteoma (Fig. Supplimentari 8F), potenzjalment involuti fir-regolazzjoni post-traskrizzjonali (48), u attività tal-fattur tat-traskrizzjoni (SREBF1, RXRG, RORA) fit-traskrittoma (Fig. Supplimentari 8G). Fibri bil-mod ġew arrikkiti fl-attività ta' oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Fig. Supplimentari 8H), rbit ta' amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Fig. Supplimentari 8I), matriċi extraċellulari (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Fig. Supplimentari 8J), u attività ta' riċettur-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Fig. Supplimentari 8K).
Biex niksbu aktar għarfien dwar ir-regolazzjoni tat-traskrizzjoni li fuqha huma bbażati l-karatteristiċi tat-tip ta' fibra tal-muskoli bil-mod/veloċi, wettaqna analiżi tal-arrikkiment tal-fatturi tat-traskrizzjoni bl-użu ta' SCENIC49 (Sett ta' Dejta Supplimentari 14). Ħafna fatturi tat-traskrizzjoni ġew arrikkiti b'mod sinifikanti bejn il-fibri tal-muskoli veloċi u bil-mod (Figura 4E). Dan inkluda fatturi ta' traskrizzjoni bħal MAFA, li qabel kien marbut mal-iżvilupp veloċi tal-fibri tal-muskoli,50 kif ukoll diversi fatturi ta' traskrizzjoni li qabel ma kinux assoċjati ma' programmi ġenetiċi speċifiċi għat-tip ta' fibra tal-muskoli. Fost dawn, PITX1, EGR1, u MYF6 kienu l-aktar fatturi ta' traskrizzjoni arrikkiti fil-fibri tal-muskoli veloċi (Figura 4E). B'kuntrast, ZSCAN30 u EPAS1 (magħruf ukoll bħala HIF2A) kienu l-aktar fatturi ta' traskrizzjoni arrikkiti fil-fibri tal-muskoli bil-mod (Figura 4E). Konsistenti ma' dan, MAFA ġie espress f'livelli ogħla fir-reġjun UMAP li jikkorrispondi għall-fibri tal-muskoli veloċi, filwaqt li EPAS1 kellu l-mudell ta' espressjoni oppost (Figura 4F).
Minbarra l-ġeni magħrufa li jikkodifikaw il-proteini, hemm bosta bijotipi ta' RNA mhux kodifikanti li jistgħu jkunu involuti fir-regolazzjoni tal-iżvilupp u l-mard tal-bniedem. 51, 52 Fis-settijiet tad-dejta tat-traskrittomi, diversi RNAs mhux kodifikanti juru speċifiċità tat-tip ta' fibra (Figura 5A u Sett tad-Dejta Supplimentari 15), inkluż LINC01405, li huwa speċifiku ħafna għal fibri bil-mod u huwa rrappurtat li huwa mnaqqas fil-muskoli minn pazjenti b'mijopatija mitokondrijali. 53 B'kuntrast, RP11-255P5.3, li jikkorrispondi għall-ġene lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, juri speċifiċità tat-tip ta' fibra mgħaġġla. Kemm LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) kif ukoll RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) juru speċifiċità tal-muskoli skeletriċi (Figuri Supplimentari 9A–B) u m'għandhom l-ebda ġeni kontrattili magħrufa fil-viċinat ġenomiku tagħhom ta' 1 Mb, li jissuġġerixxi li għandhom rwol speċjalizzat fir-regolazzjoni tat-tipi ta' fibri aktar milli fir-regolazzjoni tal-ġeni kontrattili ġirien. Il-profili ta' espressjoni speċifiċi għat-tip ta' fibra bil-mod/veloċi ta' LINC01405 u RP11-255P5.3, rispettivament, ġew ikkonfermati bl-użu ta' RNAscope (Figuri 5B–C).
A. It-traskrizzjonijiet tal-RNA mhux kodifikanti huma regolati b'mod sinifikanti fil-fibri tal-muskoli b'kontrazzjoni bil-mod u veloċi. B. Immaġni rappreżentattivi tal-RNAscope li juru l-ispeċifiċità tat-tip ta' fibra b'kontrazzjoni bil-mod u veloċi ta' LINC01405 u RP11-255P5.3, rispettivament. Skala = 50 μm. C. Kwantifikazzjoni tal-espressjoni tal-RNA mhux kodifikanti speċifika għat-tip ta' mijofibra kif determinata mill-RNAscope (n = 3 bijopsiji minn individwi indipendenti, li jqabblu l-fibri tal-muskoli veloċi u bil-mod f'kull individwu). L-analiżi statistika twettqet bl-użu ta' t-test ta' Student b'żewġ dnub. Il-plotts tal-kaxxa juru l-medjan u l-ewwel u t-tielet kwartili, bil-whiskers jindikaw il-valuri minimi u massimi. D. Fluss tax-xogħol tal-identifikazzjoni tal-proteini mikrobjali de novo (maħluq b'BioRender.com). E. Il-proteina mikrobjali LINC01405_ORF408:17441:17358 hija espressa speċifikament fil-fibri tal-muskoli skeletriċi bil-mod (n=5 bijopsiji minn parteċipanti indipendenti, li jqabblu l-fibri tal-muskoli veloċi u bil-mod f'kull parteċipant). L-analiżi statistika twettqet bl-użu tal-metodu tal-mudell lineari Limm flimkien ma' approċċ Bayesjan empiriku, segwit mill-metodu Benjamini-Hochberg għal tqabbil multiplu b'aġġustament tal-valur p. Il-plottijiet tal-kaxxa juru l-medjan, l-ewwel u t-tielet kwartili, bil-whiskers jippuntaw lejn il-valuri massimi/minimi.
Riċentement, studji wrew li ħafna traskrizzjonijiet putattivi mhux kodifikanti jikkodifikaw proteini mikrobjali traskritti, li wħud minnhom jirregolaw il-funzjoni tal-muskoli. 44, 55 Biex nidentifikaw proteini mikrobjali b'speċifiċità potenzjali tat-tip ta' fibra, fittixna fid-dataset tal-proteoma tagħna ta' 1000 fibra billi użajna fajl FASTA apposta li fih is-sekwenzi ta' traskrizzjonijiet mhux kodifikanti (n = 305) misjuba fid-dataset tat-traskrizzjoni ta' 1000 fibra (Figura 5D). Identifikajna 197 proteina mikrobjali minn 22 traskrizzjoni differenti, li 71 minnhom kienu regolati b'mod differenti bejn fibri tal-muskoli skeletriċi bil-mod u veloċi (Figura Supplimentari 9C u Sett ta' Dejta Supplimentari 16). Għal LINC01405, ġew identifikati tliet prodotti ta' proteini mikrobjali, wieħed minnhom wera speċifiċità ta' fibra bil-mod simili għat-traskrizzjoni tiegħu (Figura 5E u Figura Supplimentari 9D). Għalhekk, identifikajna LINC01405 bħala ġene li jikkodifika proteina mikrobjali speċifika għal fibri tal-muskoli skeletriċi bil-mod.
Żviluppajna fluss tax-xogħol komprensiv għall-karatterizzazzjoni proteomika fuq skala kbira ta' fibri individwali tal-muskoli u identifikajna regolaturi tal-eteroġeneità tal-fibri fi stati b'saħħithom. Applikajna dan il-fluss tax-xogħol biex nifhmu kif il-mijopatiji tan-nemalina jaffettwaw l-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi. Il-mijopatiji tan-nemalina huma mard tal-muskoli ereditarju li jikkawża dgħufija fil-muskoli u, fit-tfal affettwati, jippreżentaw firxa ta' kumplikazzjonijiet inkluż distress respiratorju, skoljożi, u mobilità limitata tar-riġlejn. 19,20 Tipikament, fil-mijopatiji tan-nemalina, varjanti patoġeniċi f'ġeni bħal actin alpha 1 (ACTA1) jirriżultaw fi predominanza ta' kompożizzjoni ta' mijofibri tal-fibri b'kontrazzjoni bil-mod, għalkemm dan l-effett huwa eteroġenju. Eċċezzjoni notevoli waħda hija l-mijopatija tan-nemalina tat-troponina T1 (TNNT1), li għandha predominanza ta' fibri veloċi. Għalhekk, fehim aħjar tal-eteroġeneità sottostanti d-disregolazzjoni tal-fibri tal-muskoli skeletriċi osservata fil-mijopatiji tan-nemalina jista' jgħin biex tiġi żvelata r-relazzjoni kumplessa bejn dawn il-mard u t-tip ta' mijofibra.
Meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom (n=3 għal kull grupp), il-mijofibri iżolati minn pazjenti b'mijopatija tan-nemalina b'mutazzjonijiet fil-ġeni ACTA1 u TNNT1 urew atrofija jew distrofija mmarkata tal-mijofibri (Figura 6A, Tabella Supplimentari 3). Dan ippreżenta sfidi tekniċi sinifikanti għall-analiżi proteomika minħabba l-ammont limitat ta' materjal disponibbli. Minkejja dan, stajna niskopru 2485 proteina f'272 mijofibra skeletali. Wara l-iffiltrar għal mill-inqas 1000 proteina kwantifikata għal kull fibra, 250 fibra ġew soġġetti għal analiżi bijoinformatika sussegwenti. Wara l-iffiltrar, ġiet kwantifikata medja ta' 1573 ± 359 proteina għal kull fibra (Figura Supplimentari 10A, Settijiet ta' Dejta Supplimentari 17–18). Ta' min jinnota li, minkejja t-tnaqqis sinifikanti fid-daqs tal-fibra, il-fond tal-proteoma tal-kampjuni tal-pazjenti b'mijopatija tan-nemalina tnaqqas biss modestament. Barra minn hekk, l-ipproċessar ta’ din id-dejta bl-użu tal-fajls FASTA tagħna stess (inklużi traskrizzjonijiet mhux kodifikanti) ippermettilna nidentifikaw ħames proteini mikrobjali f’mijofibri skeletriċi minn pazjenti b’mijopatija tan-nemalina (Sett ta’ Dejta Supplimentari 19). Il-firxa dinamika tal-proteoma kienet sinifikament usa’, u l-proteini totali fil-grupp ta’ kontroll kienu korrelati sew mar-riżultati ta’ analiżi preċedenti tal-proteoma ta’ 1000 fibra (Fig. Supplimentari 10B–C).
A. Immaġni mikroskopiċi li juru atrofija jew distrofija tal-fibri u l-predominanza ta' tipi differenti ta' fibri bbażati fuq MYH f'mijopatiji tan-nemalina (NM) ACTA1 u TNNT1. Skala = 100 μm. Biex tiġi żgurata r-riproduċibbiltà tat-tebgħa f'pazjenti ACTA1 u TNNT1, tliet bijopsiji tal-pazjenti ġew imtebbgħin minn darbtejn sa tliet darbiet (erba' sezzjonijiet għal kull każ) qabel ma ntgħażlu immaġini rappreżentattivi. B. Proporzjonijiet tat-tip ta' fibra fil-parteċipanti bbażati fuq MYH. Ċ. Plott tal-analiżi tal-komponent prinċipali (PCA) tal-fibri tal-muskoli skeletriċi f'pazjenti b'mijopatiji tan-nemalina u kontrolli. D. Fibri tal-muskoli skeletriċi minn pazjenti b'mijopatiji tan-nemalina u kontrolli pproġettati fuq plott PCA determinat mill-1000 fibra analizzati fil-Figura 2. Pereżempju, plotts tal-vulkan li jqabblu d-differenzi bejn parteċipanti b'mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1 u kontrolli, u bejn parteċipanti b'mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1. Ċrieki kkuluriti jindikaw proteini li kienu differenti b'mod sinifikanti f'π < 0.05, u tikek skuri jindikaw proteini li kienu differenti b'mod sinifikanti f'FDR < 0.05. L-analiżi statistika twettqet bl-użu tal-metodu tal-mudell lineari Limma u metodi Bayesjani empiriċi, segwita minn aġġustament tal-valur p għal paraguni multipli bl-użu tal-metodu Benjamini-Hochberg. H. Analiżi ta' arrikkiment ta' proteini espressi b'mod differenzjali sinifikanti fil-proteoma kollha u fil-fibri tat-tip 1 u 2A. L-analiżi statistika twettqet bl-użu tal-pakkett clusterProfiler u valuri p aġġustati minn Benjamini-Hochberg. I, J. Plotts tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) ikkuluriti skont termini tal-matriċi extraċellulari u tal-ontoloġija tal-ġeni mitokondrijali (GO).
Minħabba li l-mijopatiji tan-nemalina jistgħu jinfluwenzaw il-proporzjon tat-tipi ta' mijofibri li jesprimu MYH fil-muskolu skeletali,19,20 l-ewwel eżaminajna t-tipi ta' mijofibri li jesprimu MYH f'pazjenti b'mijopatiji tan-nemalina u kontrolli. Iddeterminajna t-tip ta' mijofibra bl-użu ta' metodu imparzjali deskritt qabel għall-assaġġ ta' 1000 mijofibra (Figuri Supplimentari 10D–E) u għal darb'oħra fallejna milli nidentifikaw mijofibri puri 2X (Figura 6B). Osservajna effett eteroġenju tal-mijopatiji tan-nemalina fuq it-tip ta' mijofibra, peress li żewġ pazjenti b'mutazzjonijiet ACTA1 kellhom proporzjon akbar ta' mijofibri tat-tip 1, filwaqt li żewġ pazjenti b'mijopatija tan-nemalina TNNT1 kellhom proporzjon imnaqqas ta' mijofibri tat-tip 1 (Figura 6B). Tabilħaqq, l-espressjoni ta' MYH2 u isoformi ta' troponina mgħaġġla (TNNC2, TNNI2, u TNNT3) kienet imnaqqsa fil-mijopatiji ACTA1-nemalina, filwaqt li l-espressjoni ta' MYH7 kienet imnaqqsa fil-mijopatiji TNNT1-nemalina (Figura Supplimentari 11A). Dan huwa konsistenti ma' rapporti preċedenti ta' bdil tat-tip ta' mijofibri eteroġenji fil-mijopatiji nemalini.19,20 Aħna kkonfermajna dawn ir-riżultati permezz ta' immunoistokimika u sibna li pazjenti b'mijopatija ACTA1-nemalina kellhom predominanza ta' mijofibri tat-tip 1, filwaqt li pazjenti b'mijopatija TNNT1-nemalina kellhom ix-xejra opposta (Figura 6A).
Fil-livell tal-proteoma ta' fibra waħda, il-fibri tal-muskoli skeletriċi minn pazjenti b'mijopatija tan-nemalina ACTA1 u TNNT1 inġabru mal-maġġoranza tal-fibri ta' kontroll, bil-fibri b'mijopatija tan-nemalina TNNT1 ġeneralment ikunu l-aktar affettwati severament (Figura 6C). Dan kien partikolarment evidenti meta ġew ipplottjati plottijiet tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) ta' fibri psewdo-minfuħin għal kull pazjent, bil-pazjenti 2 u 3 b'mijopatija tan-nemalina TNNT1 jidhru l-aktar 'il bogħod mill-kampjuni ta' kontroll (Figura Supplimentari 11B, Sett ta' Dejta Supplimentari 20). Biex nifhmu aħjar kif il-fibri minn pazjenti b'mijopatija jitqabblu ma' fibri b'saħħithom, użajna informazzjoni dettaljata miksuba minn analiżi proteomika ta' 1,000 fibra minn parteċipanti adulti b'saħħithom. Ipproġettajna fibri mid-dataset tal-mijopatija (pazjenti u kontrolli b'mijopatija tan-nemalina ACTA1 u TNNT1) fuq il-plott PCA miksub mill-analiżi proteomika ta' 1000 fibra (Figura 6D). Id-distribuzzjoni tat-tipi ta' fibri MYH tul PC2 fil-fibri ta' kontroll kienet simili għad-distribuzzjoni tal-fibri miksuba mill-analiżi proteomika ta' 1000 fibra. Madankollu, il-biċċa l-kbira tal-fibri f'pazjenti b'mijopatija tan-nemalina mxew 'l isfel lejn PC2, u kkoinċidew ma' fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla b'saħħithom, irrispettivament mit-tip ta' fibra MYH nattiva tagħhom. Għalhekk, għalkemm pazjenti b'mijopatija tan-nemalina ACTA1 urew bidla lejn fibri tat-tip 1 meta kwantifikati bl-użu ta' metodi bbażati fuq MYH, kemm il-mijopatija tan-nemalina ACTA1 kif ukoll il-mijopatija tan-nemalina TNNT1 imxew il-proteoma tal-fibra tal-muskolu skeletali lejn fibri b'kontrazzjoni mgħaġġla.
Imbagħad qabbilna direttament kull grupp ta' pazjenti ma' kontrolli b'saħħithom u identifikajna 256 u 552 proteina espressa b'mod differenzjali fil-mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1, rispettivament (Figura 6E–G u Figura Supplimentari 11C, Sett ta' Dejta Supplimentari 21). L-analiżi tal-arrikkiment tal-ġeni żvelat tnaqqis koordinat fil-proteini mitokondrijali (Figura 6H–I, Sett ta' Dejta Supplimentari 22). B'mod sorprendenti, minkejja l-predominanza differenzjali tat-tipi ta' fibri fil-mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1, dan it-tnaqqis kien kompletament indipendenti mit-tip ta' fibra bbażata fuq MYH (Figura 6H u Figuri Supplimentari 11D–I, Sett ta' Dejta Supplimentari 23). Tliet proteini mikrobjali kienu wkoll regolati fil-mijopatiji tan-nemalina ACTA1 jew TNNT1. Tnejn minn dawn il-mikroproteini, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (magħruf ukoll bħala LINC00598 jew Lnc-FOXO1) u ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), urew abbundanza differenzjali biss fil-mijofibri tat-tip 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 ġie rrappurtat qabel li għandu rwol fir-regolazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli. 56 Min-naħa l-oħra, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (li jikkorrispondi għal LINC01798) żdied kemm fil-mijofibri tat-tip 1 kif ukoll tat-tip 2A fil-mijopatija ACTA1-nemalina meta mqabbel ma' kontrolli b'saħħithom (Figura Supplimentari 12A, Sett ta' Dejta Supplimentari 24). B'kuntrast, il-proteini ribosomali fil-biċċa l-kbira ma kinux affettwati mill-mijopatija tan-nemalina, għalkemm RPS17 kien imnaqqas fil-mijopatija tan-nemalina ACTA1 (Fig. 6E).
L-analiżi tal-arrikkiment żvelat ukoll żieda fil-proċessi tas-sistema immunitarja fil-mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1, filwaqt li l-adeżjoni taċ-ċelluli żdiedet ukoll fil-mijopatija tan-nemalina TNNT1 (Figura 6H). L-arrikkiment ta’ dawn il-fatturi extraċellulari kien rifless mill-proteini tal-matriċi extraċellulari li mxew il-PCA fil-PC1 u l-PC2 f’direzzjoni negattiva (jiġifieri, lejn il-fibri l-aktar affettwati) (Figura 6J). Iż-żewġ gruppi ta’ pazjenti wrew żieda fl-espressjoni tal-proteini extraċellulari involuti fir-risponsi immuni u l-mekkaniżmi ta’ tiswija sarkolemmali, bħal annessini (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 u l-proteina interattiva tagħhom S100A1159 (Figuri Supplimentari 12B–C). Dan il-proċess ġie rrappurtat qabel li huwa msaħħaħ fid-distrofiji muskolari60 iżda, safejn nafu aħna, ma kienx assoċjat qabel ma’ mijopatiji tan-nemalina. Il-funzjoni normali ta’ din il-makkinarju molekulari hija meħtieġa għat-tiswija sarkolemmali wara korriment u għall-fużjoni ta’ mijoċiti ffurmati ġodda mal-mijofibri58,61. Għalhekk, iż-żieda fl-attività ta' dan il-proċess fiż-żewġ gruppi ta' pazjenti tissuġġerixxi rispons riparattiv għal ħsara kkawżata minn instabbiltà tal-mijofibra.
L-effetti ta' kull mijopatija tan-nemalina kienu korrelati sew (r = 0.736) u wrew sovrappożizzjoni raġonevoli (Figuri Supplimentari 11A–B), li jindika li l-mijopatija tan-nemalina ACTA1 u TNNT1 għandhom effetti simili fuq il-proteoma. Madankollu, xi proteini kienu regolati biss fil-mijopatija tan-nemalina ACTA1 jew TNNT1 (Figuri Supplimentari 11A u C). Il-proteina profibrotika MFAP4 kienet waħda mill-aktar proteini regolati 'l fuq fil-mijopatija tan-nemalina TNNT1 iżda baqgħet l-istess fil-mijopatija tan-nemalina ACTA1. SKIC8, komponent tal-kumpless PAF1C responsabbli għar-regolazzjoni tat-traskrizzjoni tal-ġene HOX, kien regolat 'l isfel fil-mijopatija tan-nemalina TNNT1 iżda ma ġiex affettwat fil-mijopatija tan-nemalina ACTA1 (Figura Supplimentari 11A). Paragun dirett tal-mijopatija tan-nemalina ACTA1 u TNNT1 żvela tnaqqis akbar fil-proteini mitokondrijali u żidiet fil-proteini tas-sistema immunitarja fil-mijopatija tan-nemalina TNNT1 (Figura 6G–H u Figuri Supplimentari 11C u 11H–I). Din id-dejta hija konsistenti mal-atrofija/distrofija akbar osservata fil-mijopatija tan-nemalina TNNT1 meta mqabbla mal-mijopatija tan-nemalina TNNT1 (Figura 6A), li tissuġġerixxi li l-mijopatija tan-nemalina TNNT1 tirrappreżenta forma aktar severa tal-marda.
Biex nivvalutaw jekk l-effetti osservati tal-mijopatija tan-nemalina jippersistux fil-livell tal-muskolu kollu, wettaqna analiżi proteomika bl-ingrossa ta' bijopsiji tal-muskoli mill-istess grupp ta' pazjenti b'mijopatija tan-nemalina TNNT1 u qabbilhom mal-kontrolli (n=3 għal kull grupp) (Fig. Supplimentari 13A, Sett ta' Dejta Supplimentari 25). Kif mistenni, il-kontrolli kienu relatati mill-qrib fl-analiżi tal-komponenti prinċipali, filwaqt li pazjenti b'mijopatija tan-nemalina TNNT1 urew varjabbiltà interkampjun ogħla simili għal dik li dehret fl-analiżi ta' fibra waħda (Fig. Supplimentari 13B). L-analiżi bl-ingrossa rriproduċiet il-proteini espressi b'mod differenzjali (Fig. Supplimentari 13C, Sett ta' Dejta Supplimentari 26) u l-proċessi bijoloġiċi (Fig. Supplimentari 13D, Sett ta' Dejta Supplimentari 27) enfasizzati billi qabblu fibri individwali, iżda tilfet il-ħila li tiddistingwi bejn tipi differenti ta' fibri u naqset milli tqis l-effetti eteroġenji tal-marda fil-fibri kollha.
Meħuda flimkien, din id-dejta turi li l-proteomika ta' mijofibra waħda tista' tiċċara karatteristiċi bijoloġiċi kliniċi li mhumiex skoperti b'metodi mmirati bħall-immunoblotting. Barra minn hekk, din id-dejta tenfasizza l-limitazzjonijiet tal-użu tat-tipifikazzjoni tal-fibra tal-actin (MYH) waħedha biex tiddeskrivi l-adattament fenotipiku. Tabilħaqq, għalkemm il-bdil tat-tip ta' fibra jvarja bejn il-mijopatiji tan-nemalina tal-actin u tat-troponin, iż-żewġ mijopatiji tan-nemalina jisseparaw it-tipifikazzjoni tal-fibra MYH mill-metaboliżmu tal-fibra tal-muskoli skeletriċi lejn proteoma tal-muskoli aktar mgħaġġla u inqas ossidattiva.
L-eteroġeneità ċellulari hija kritika biex it-tessuti jissodisfaw id-domandi diversi tagħhom. Fil-muskolu skeletriku, dan ħafna drabi jiġi deskritt bħala tipi ta' fibri kkaratterizzati minn gradi differenti ta' produzzjoni ta' forza u għeja. Madankollu, huwa ċar li dan jispjega biss parti żgħira mill-varjabbiltà tal-fibri tal-muskolu skeletriku, li hija ħafna aktar varjabbli, kumplessa u b'ħafna aspetti milli kien maħsub qabel. L-avvanzi teknoloġiċi issa tefgħu dawl fuq il-fatturi li jirregolaw il-fibri tal-muskolu skeletriku. Tabilħaqq, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-fibri tat-tip 2X jistgħu ma jkunux sottotip distint ta' fibra tal-muskolu skeletriku. Barra minn hekk, identifikajna proteini metaboliċi, proteini ribosomali u proteini assoċjati maċ-ċelloli bħala determinanti ewlenin tal-eteroġeneità tal-fibri tal-muskolu skeletriku. Billi applikajna l-fluss tax-xogħol proteomiku tagħna għal kampjuni ta' pazjenti b'mijopatija tan-nematodi, urejna aktar li t-tajping tal-fibri bbażat fuq MYH ma jirriflettix bis-sħiħ l-eteroġeneità tal-muskolu skeletriku, speċjalment meta s-sistema tkun imfixkla. Tabilħaqq, irrispettivament mit-tip ta' fibra bbażata fuq MYH, il-mijopatija tan-nematodi tirriżulta f'bidla lejn fibri aktar mgħaġġla u inqas ossidattivi.
Il-fibri tal-muskoli skeletriċi ilhom jiġu kklassifikati mis-seklu 19. Analiżijiet omici reċenti ppermettewlna nibdew nifhmu l-profili ta' espressjoni ta' tipi differenti ta' fibri MYH u r-risponsi tagħhom għal stimuli differenti. Kif deskritt hawn, l-approċċi omici għandhom ukoll il-vantaġġ ta' sensittività akbar għall-kwantifikazzjoni ta' markaturi tat-tip ta' fibra milli metodi tradizzjonali bbażati fuq antikorpi, mingħajr ma niddependu fuq il-kwantifikazzjoni ta' markatur wieħed (jew ftit) biex niddefinixxu tip ta' fibra tal-muskoli skeletriċi. Użajna flussi tax-xogħol traskrittomiċi u proteomiċi komplementari u integrajna r-riżultati biex neżaminaw ir-regolazzjoni traskrizzjonali u post-traskrizzjonali tal-eteroġeneità tal-fibra fil-fibri tal-muskoli skeletriċi umani. Dan il-fluss tax-xogħol irriżulta fin-nuqqas li jiġu identifikati fibri puri tat-tip 2X fil-livell tal-proteina fil-vastus lateralis tal-grupp tagħna ta' rġiel żgħażagħ b'saħħithom. Dan huwa konsistenti ma' studji preċedenti ta' fibra waħda li sabu <1% fibri puri 2X f'vastus lateralis b'saħħtu, għalkemm dan għandu jiġi kkonfermat f'muskoli oħra fil-futur. Id-diskrepanza bejn l-iskoperta ta' fibri 2X kważi puri fil-livell tal-mRNA u fibri mħallta 2A/2X biss fil-livell tal-proteina hija konfuża. L-espressjoni tal-mRNA tal-isoforma MYH mhijiex ċirkadjana,67 li tissuġġerixxi li mhux probabbli li "tlifna" s-sinjal tal-bidu tal-MYH2 f'fibri 2X apparentement puri fil-livell tal-RNA. Spjegazzjoni waħda possibbli, għalkemm purament ipotetika, tista' tkun id-differenzi fl-istabbiltà tal-proteini u/jew tal-mRNA bejn l-isoformi MYH. Tabilħaqq, l-ebda fibra veloċi mhi 100% pura għal kwalunkwe isoforma MYH, u mhux ċar jekk il-livelli ta' espressjoni tal-mRNA MYH1 fil-medda ta' 70–90% jirriżultawx f'abbundanza ugwali ta' MYH1 u MYH2 fil-livell tal-proteini. Madankollu, meta wieħed jikkunsidra t-traskrittoma jew il-proteoma kollha, l-analiżi tal-clusters tista' tidentifika b'kunfidenza biss żewġ gruppi distinti li jirrappreżentaw fibri tal-muskoli skeletriċi bil-mod u veloċi, irrispettivament mill-kompożizzjoni preċiża tal-MYH tagħhom. Dan huwa konsistenti ma' analiżijiet li jużaw approċċi traskrittomiċi ta' nukleu wieħed, li tipikament jidentifikaw biss żewġ gruppi mijonukleari distinti. 68, 69, 70 Barra minn hekk, għalkemm studji proteomiċi preċedenti identifikaw fibri tat-tip 2X, dawn il-fibri ma jinġabrux separatament mill-bqija tal-fibri veloċi u juru biss numru żgħir ta’ proteini abbundanti b’mod differenti meta mqabbla ma’ tipi oħra ta’ fibri bbażati fuq MYH. 14 Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li għandna nerġgħu lura għall-fehma tal-bidu tas-seklu 20 dwar il-klassifikazzjoni tal-fibri tal-muskoli, li qasmet il-fibri tal-muskoli skeletriċi umani mhux fi tliet klassijiet distinti bbażati fuq MYH, iżda f’żewġ gruppi bbażati fuq il-proprjetajiet metaboliċi u kontrattili tagħhom. 63
Aktar importanti minn hekk, l-eteroġeneità tal-mijofibri għandha tiġi kkunsidrata tul diversi dimensjonijiet. Studji "omiċi" preċedenti indikaw f'din id-direzzjoni, u ssuġġerixxew li l-fibri tal-muskoli skeletriċi ma jiffurmawx gruppi diskreti iżda huma rranġati tul kontinwu. 11, 13, 14, 64, 71 Hawnhekk, nuru li, minbarra d-differenzi fil-proprjetajiet kontrattili u metaboliċi tal-muskolu skeletriċi, il-mijofibri jistgħu jiġu differenzjati permezz ta' karatteristiċi relatati mal-interazzjonijiet bejn iċ-ċellula u l-mekkaniżmi ta' traduzzjoni. Tabilħaqq, sibna eteroġeneità tar-ribosomi fil-fibri tal-muskoli skeletriċi li tikkontribwixxi għall-eteroġeneità indipendentement mit-tipi ta' fibri bil-mod u veloċi. Il-kawża sottostanti ta' din l-eteroġeneità sostanzjali tal-mijofibri, indipendentement mit-tip ta' fibra bil-mod u veloċi, tibqa' mhux ċara, iżda tista' tipponta lejn organizzazzjoni spazjali speċjalizzata fi ħdan il-fascikoli tal-muskoli li jirrispondu b'mod ottimali għal forzi u tagħbijiet speċifiċi,72 komunikazzjoni ċellulari jew speċifika għall-organi speċjalizzata ma' tipi oħra ta' ċelluli fil-mikroambjent tal-muskoli73,74,75 jew differenzi fl-attività tar-ribosomi fi ħdan mijofibri individwali. Tabilħaqq, l-eteroplasmija ribosomali, jew permezz ta' sostituzzjoni paraloga ta' RPL3 u RPL3L jew fil-livell ta' 2'O-metilazzjoni ta' rRNA, intweriet li hija assoċjata ma' ipertrofija tal-muskoli skeletriċi76,77. Applikazzjonijiet multi-omiċi u spazjali flimkien mal-karatterizzazzjoni funzjonali ta' mijofibri individwali se javvanzaw aktar il-fehim tagħna tal-bijoloġija tal-muskoli fil-livell multi-omiku78.
Billi analizzajna l-proteomi ta' mijofibri singoli minn pazjenti b'mijopatiji tan-nemalina, wrejna wkoll l-utilità, l-effettività, u l-applikabbiltà tal-proteomika ta' mijofibra waħda biex tiċċara l-patofiżjoloġija klinika tal-muskolu skeletriku. Barra minn hekk, billi qabbilna l-fluss tax-xogħol tagħna mal-analiżi proteomika globali, stajna nuru li l-proteomika ta' mijofibra waħda tagħti l-istess fond ta' informazzjoni bħall-proteomika tat-tessut globali u testendi dan il-fond billi tqis l-eteroġeneità interfibri u t-tip ta' mijofibra. Minbarra d-differenzi mistennija (għalkemm varjabbli) fil-proporzjon tat-tip ta' fibra osservati fil-mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1 meta mqabbla ma' kontrolli b'saħħithom,19 osservajna wkoll rimudellar ossidattiv u extraċellulari indipendenti mill-bdil tat-tip ta' fibra medjat minn MYH. Il-fibrożi ġiet irrappurtata qabel f'mijopatiji tan-nemalina TNNT1.19 Madankollu, l-analiżi tagħna tibni fuq din is-sejba billi tiżvela wkoll livelli miżjuda ta' proteini relatati mal-istress imnixxija extraċellulari, bħal annessini, involuti f'mekkaniżmi ta' tiswija sarkolemmali, f'mijofibri minn pazjenti b'mijopatiji tan-nemalina ACTA1 u TNNT1.57,58,59 Bħala konklużjoni, livelli miżjuda ta' annessin f'mijofibri minn pazjenti b'mijopatija tan-nemalina jistgħu jirrappreżentaw rispons ċellulari għat-tiswija ta' mijofibri severament atrofiċi.
Għalkemm dan l-istudju jirrappreżenta l-akbar analiżi tal-omika tal-muskoli sħaħ b'fibra waħda tal-bnedmin sal-lum, mhuwiex mingħajr limitazzjonijiet. Iżolajna fibri tal-muskoli skeletriċi minn kampjun relattivament żgħir u omoġenju ta' parteċipanti u muskolu wieħed (il-vastus lateralis). Għalhekk, huwa impossibbli li tiġi eskluża l-eżistenza ta' popolazzjonijiet speċifiċi ta' fibri fit-tipi ta' muskoli u fl-estremi tal-fiżjoloġija tal-muskoli. Pereżempju, ma nistgħux neskludu l-possibbiltà ta' sottosett ta' fibri ultraveloċi (eż., fibri puri 2X) li joħorġu fi sprinters imħarrġa ħafna u/jew atleti tas-saħħa79 jew matul perjodi ta' inattività muskolari66,80. Barra minn hekk, id-daqs limitat tal-kampjun tal-parteċipanti żammna milli ninvestigaw id-differenzi bejn is-sessi fl-eteroġeneità tal-fibri, peress li l-proporzjonijiet tat-tipi ta' fibri huma magħrufa li jvarjaw bejn l-irġiel u n-nisa. Barra minn hekk, ma stajniex inwettqu analiżi traskrittomiċi u proteomiċi fuq l-istess fibri tal-muskoli jew kampjuni mill-istess parteċipanti. Hekk kif aħna u oħrajn inkomplu nottimizzaw l-analiżi ta' ċellula waħda u ta' mijofibra waħda bl-użu tal-analiżi omika biex niksbu input ta' kampjuni ultra-baxx (kif muri hawn fl-analiżi tal-fibri minn pazjenti b'mijopatija mitokondrijali), l-opportunità li jiġu kkombinati approċċi multi-omiċi (u funzjonali) fi ħdan fibri tal-muskoli singoli ssir apparenti.
B'mod ġenerali, id-dejta tagħna tidentifika u tispjega x-xprunaturi traskrizzjonali u post-traskrizzjonali tal-eteroġeneità tal-muskoli skeletriċi. Speċifikament, nippreżentaw dejta li tisfida dogma li ilha teżisti fil-fiżjoloġija tal-muskoli skeletriċi assoċjata mad-definizzjoni klassika tat-tipi ta' fibri bbażata fuq l-MYH. Nittamaw li nġeddu d-dibattitu u fl-aħħar mill-aħħar naħsbu mill-ġdid dwar il-fehim tagħna tal-klassifikazzjoni u l-eteroġeneità tal-fibri tal-muskoli skeletriċi.
Erbatax-il parteċipant Kawkasi (12-il raġel u żewġ nisa) qablu volontarjament li jieħdu sehem f'dan l-istudju. L-istudju ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Isptar Universitarju ta' Ghent (BC-10237), ikkonforma mad-Dikjarazzjoni ta' Helsinki tal-2013, u ġie rreġistrat fuq ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Il-karatteristiċi ġenerali tal-parteċipanti huma ppreżentati fit-Tabella Supplimentari 1. Wara li kisbu l-kunsens infurmat verbali u bil-miktub, il-parteċipanti għaddew minn eżami mediku qabel l-inklużjoni finali fl-istudju. Il-parteċipanti kienu żgħar (22–42 sena), b'saħħithom (l-ebda kundizzjonijiet mediċi, l-ebda storja ta' tipjip), u moderatament attivi fiżikament. L-assorbiment massimu tal-ossiġnu ġie determinat bl-użu ta' ergometru pass biex jiġi vvalutat il-kundizzjoni fiżika kif deskritt qabel. 81
Kampjuni ta' bijopsija tal-muskoli nġabru waqt il-mistrieħ u fi stat ta' sawm tliet darbiet, 14-il jum 'il bogħod minn xulxin. Minħabba li dawn il-kampjuni nġabru bħala parti minn studju akbar, il-parteċipanti kkonsmaw plaċebo (lattożju), antagonist tar-riċettur H1 (540 mg fexofenadine), jew antagonist tar-riċettur H2 (40 mg famotidine) 40 minuta qabel il-bijopsija. Aħna diġà wrejna li dawn l-antagonisti tar-riċetturi tal-istamina ma jaffettwawx il-kundizzjoni fiżika tal-muskoli skeletriċi waqt il-mistrieħ81, u ma ġie osservat l-ebda raggruppament relatat mal-istat fil-plottijiet tal-kontroll tal-kwalità tagħna (Figuri Supplimentari 3 u 6). Dieta standardizzata (41.4 kcal/kg piż tal-ġisem, 5.1 g/kg karboidrati piż tal-ġisem, 1.4 g/kg proteina piż tal-ġisem, u 1.6 g/kg xaħam piż tal-ġisem) inżammet għal 48 siegħa qabel kull jum sperimentali, u kolazzjon standardizzat (1.5 g/kg karboidrati piż tal-ġisem) ġie kkunsmat filgħodu tal-jum sperimentali. Taħt anestesija lokali (0.5 ml 1% lidocaine mingħajr epinephrine), inkisbu bijopsiji tal-muskoli mill-muskolu vastus lateralis bl-użu ta' aspirazzjoni perkutanja ta' Bergström.82 Kampjuni tal-muskoli ġew immedjatament inkorporati f'RNAlater u maħżuna f'4°C sakemm saret dissezzjoni manwali tal-fibri (sa 3 ijiem).
Mazzi ta' mijofibri iżolati friski ġew trasferiti għal mezz RNAlater frisk f'dixx tal-kultura. Il-mijofibri individwali mbagħad ġew dissezzjonati manwalment bl-użu ta' stereomikroskopju u pinzetta fina. Ħamsa u għoxrin fibra ġew dissezzjonati minn kull bijopsija, b'attenzjoni speċjali għall-għażla tal-fibri minn żoni differenti tal-bijopsija. Wara d-dissezzjoni, kull fibra ġiet mgħaddsa bil-mod fi 3 μl ta' buffer tal-liżi (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) li fih enzimi proteinase K u DNase biex jitneħħew proteini u DNA mhux mixtieqa. Il-liżi taċ-ċelluli u t-tneħħija tal-proteini/DNA mbagħad inbdew permezz ta' vortiċijar qasir, tidwir tal-likwidu f'mikroċentrifuga, u inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra (10 min). Il-liżat imbagħad ġie inkubat f'ċiklatur termali (T100, Bio-Rad) f'37°C għal 5 min, 75°C għal 5 min, u mbagħad maħżun immedjatament f'-80°C sakemm jiġi pproċessat aktar.
Libreriji tal-RNA poliadenilat kompatibbli mal-Illumina ġew ippreparati minn 2 µl ta' lisat tal-mijofibra bl-użu tal-QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Metodi dettaljati jistgħu jinstabu fil-manwal tal-manifattur. Il-proċess jibda bis-sintesi tas-cDNA tal-ewwel linja permezz ta' traskrizzjoni inversa, li matulha jiġu introdotti identifikaturi molekulari uniċi (UMIs) u barcodes i1 speċifiċi għall-kampjun biex jiġi żgurat il-ġbir tal-kampjuni u titnaqqas il-varjabbiltà teknika waqt l-ipproċessar downstream. Is-cDNA minn 96 mijofibra mbagħad jiġi miġbur u ppurifikat b'żibeġ manjetiċi, wara li l-RNA jitneħħa u s-sintesi tat-tieni linja titwettaq bl-użu ta' primers każwali. Il-librerija tiġi ppurifikata b'żibeġ manjetiċi, jiżdiedu tikketti i5/i7 speċifiċi għall-ġabra, u l-PCR jiġi amplifikat. Pass finali ta' purifikazzjoni jipproduċi libreriji kompatibbli mal-Illumina. Il-kwalità ta' kull ġabra ta' libreriji ġiet ivvalutata bl-użu tal-High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Abbażi tal-kwantifikazzjoni tal-Qubit, il-pools ġew miġbura aktar f'konċentrazzjonijiet ekwimolari (2 nM). Il-pool li rriżulta mbagħad ġie sekwenzat fuq strument NovaSeq 6000 f'modalità standard bl-użu tal-NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotidi) b'tagħbija ta' 2 nM (4% PhiX).
Il-pipeline tagħna huwa bbażat fuq il-pipeline tal-analiżi tad-dejta QuantSeq Pool ta' Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Id-dejta l-ewwel ġiet demultiplexata b'bcl2fastq2 (v2.20.0) ibbażat fuq l-indiċi i7/i5. Il-Qari 2 imbagħad ġie demultiplexat b'idemux (v0.1.6) ibbażat fuq il-barcode tal-kampjun i1 u s-sekwenzi UMI ġew estratti b'umi_tools (v1.0.1). Il-qari mbagħad ġie mnaqqas b'cutadapt (v3.4) f'rawnds multipli biex jitneħħew qari qasir (<20 fit-tul) jew qari li jikkonsisti biss minn sekwenzi ta' adapter. Il-qari mbagħad ġie allinjat mal-ġenoma tal-bniedem bl-użu ta' STAR (v2.6.0c) u l-fajls BAM ġew indiċjati b'SAMtools (v1.11). Qari duplikat tneħħa bl-użu ta' umi_tools (v1.0.1). Fl-aħħar, l-għadd tal-allinjament twettaq bl-użu ta' featureCounts f'Subread (v2.0.3). Il-kontroll tal-kwalità twettaq bl-użu ta' FastQC (v0.11.9) f'diversi stadji intermedji tal-proċess.
L-ipproċessar u l-viżwalizzazzjoni bijoinformatika ulterjuri kollha twettqu f'R (v4.2.3), primarjament bl-użu tal-fluss tax-xogħol Seurat (v4.4.0). 83 Għalhekk, il-valuri UMI individwali u l-matriċi tal-metadata ġew trasformati f'oġġetti Seurat. Il-ġeni espressi f'inqas minn 30% tal-fibri kollha tneħħew. Kampjuni ta' kwalità baxxa tneħħew abbażi ta' limitu minimu ta' 1000 valur UMI u 1000 ġene skopert. Fl-aħħar mill-aħħar, 925 fibra għaddew mill-passi kollha ta' filtrazzjoni tal-kontroll tal-kwalità. Il-valuri UMI ġew normalizzati bl-użu tal-metodu Seurat SCTransform v2, 84 inklużi s-7418-il karatteristika skoperta kollha, u d-differenzi bejn il-parteċipanti ġew imneħħija b'rigressjoni. Il-metadata rilevanti kollha tista' tinstab fid-Dataset Supplimentari 28.